全外显子基因检测的第一步是获取高质量的DNA样本。通常采用静脉血（10ml）作为标准样本，特殊情况下也可使用唾液或组织活检。采集后需进行离心分离提取白细胞中的DNA，并确保运输过程中温度控制在-20℃至-25℃以保持稳定性。实验室会对样本进行浓度和纯度检测（A260/A280值需在1.6~2.2之间），剔除降解或污染的样本。部分机构还要求同步采集家族成员样本用于家系验证，尤其针对遗传病诊断场景。
2. 文库构建与捕获
DNA样本经片段化后，通过杂交捕获技术富集外显子区域。这一过程需加入封闭接头序列（Blocker）和Cot DNA，前者阻止非特异性杂交，后者抑制原始DNA链重新配对。探针（带生物素标记）会特异性结合目标外显子，再通过链霉素磁珠吸附捕获复合物。文库构建需验证最低DNA起始量（通常200ng），并设置阳性质控品（如标准细胞系）和空白对照，以监控建库成功率。构建完成的文库需通过电泳或Qubit检测片段大小（通常150~200bp）和浓度，不合格的文库需重新制备。
3. 高通量测序
捕获后的文库会上机进行高通量测序，主流平台如Illumina NovaSeq 6000。测序前需校准仪器并评估试剂批次稳定性，关键参数包括单碱基质量Q30≥70%、目标区域平均覆盖深度≥100×（重要区域需达200×）。双末端测序（PE150）是主流方案，可提高检测准确性。测序过程中需加入标准品文库监控数据波动，原始数据（BCL格式）会实时转换为FASTQ文件供后续分析。若发现重复读数百分比过高或覆盖不均，需重新优化实验条件。
4. 生物信息学分析
下机数据需经过多步生物信息处理：首先使用BWA比对到参考基因组（如GRCh38），再通过GATK进行碱基质量校正和变异检测（包括SNV、Indel和CNV）。数据分析需结合千人基因组、gnomAD等公共数据库过滤人群高频变异，并通过ACMG指南对变异进行临床分级（致病性/可能致病性/VUS）。针对遗传病案例，还需进行家系共分离分析。部分实验室采用自动化流程（如复旦流程2.0）加速分析，将平均用时从78.8小时缩短至19.8小时。创新科技网 Www.ZQcYZg.COm
5. 报告解读与遗传咨询
最终报告需经双人复核，明确标注致病性突变、次要发现（如BRCA突变）和临床意义未明变异（VUS）。报告解读需结合患者表型，例如对先天性心脏病胎儿优先排查CHD7、TBX5等基因。遗传咨询师会面对面解释结果（至少1小时），涉及疾病风险、家族遗传模式及干预建议。部分机构提供动态追踪服务，当新研究证实VUS的临床意义时更新报告。值得注意的是，约15%~30%的病例可能无法通过WES确诊，需考虑全基因组测序或表观遗传学检测补充。
